马氏的祖上曾是归德府宿州富豪。父亲马公家住新丰里，由于乐善好施，所以家业日渐贫困。母亲郑媪，在1332年生下马氏不久就去世了。马公没有儿子，视马氏为掌上明珠。马氏自幼聪明，能诗会画，尤善史书，性格也颇倔强。
马氏的父亲马公因为杀人避仇，逃亡他乡，临行时将爱女托付给生死之交郭子兴。郑媪早卒，其后马公也客死外地，郭子兴越发可怜此女孤苦，收为养女。郭子兴教她文化知识，夫人张氏则手把手教她针织刺绣。十几岁的马氏聪明无比，凡事一经指导，马上知晓。年近二十的马氏，模样端庄，神情秀越，还有一种温婉的态度，无论何等急事，她总举止从容，并没有疾言厉色，所以郭子兴夫妇很是钟爱马氏，一直想给她找一个好夫婿，使她终身有托，不辜负马公遗言。
嫁朱元璋
元朝末年，政治腐败，社会黑暗，阶级压迫和民族压迫使老百姓处于水深火热之中，元至正四年（公元1344年），河南、江淮一带大旱，赤地千里，而黄河又接连决口，饥民遍野。到至正十一年（1351年），河患已经连续六年，天灾人祸把广大农民推向死亡的边缘。这年五月，江淮流域终于爆发了以刘福通为首的大规模的红巾军起义。
1352年（至正十二年），郭子兴在定远（安徽定远）起兵响应。郭子兴聚众烧香，成为当地白莲教的首领，同年农历二月二十七日，率领起义军攻下濠州后，郭子兴自称元帅。
濠州钟离人朱元璋前来投奔郭子兴的义军，朱元璋入伍后精明能干，处事得当，打仗时身先士卒，获得的战利品全部都上交郭子兴元帅，得了赏赐，又说功劳是大家的，就把赏赐分给大家。不久，朱元璋在部队中的好名声传播开来。郭子兴也把他视作心腹知己，有重要事情总是和朱元璋商量 。
郭子兴见朱元璋是个人才，对自己的事业将会有很大的帮助。于是便把养女马氏许配给了朱元璋。马氏与朱元璋成亲后，和朱元璋感情深厚，追随朱元璋南征北战，精心辅佐朱元璋。
马氏与朱元璋婚后不久，收养了朱元璋的亲侄儿朱文正、外甥李文忠还有定远孤儿沐英，马氏对这三个养子视如己出，细心照顾。后来，马氏和朱元璋又收养了二十几个义子。
夫唱妇随
郭子兴虽然器重朱元璋，但他性情暴躁，忌才护短，又好听谗言，迟疑寡断，在别人的挑唆下，也曾多次猜疑朱元璋，对他加以斥骂。一次，郭子兴发怒，将朱元璋禁闭在空室，不许进食，马氏得知后，亲自到厨房，“窃炊饼，怀以进，肉为焦”。马氏见此情形，就把自家财产送给养母张夫人和郭子兴妾张氏，请她们在义父前给干女婿说点好话，以弥缝裂痕，使得朱元璋能脱离困境。朱元璋南下之时，马氏曾负责往来的文书，并做得井井有条，同时她还劝朱元璋不要扰民，更不要滥杀，深得朱元璋的赞赏。
元至正十五年（公元1355年），朱元璋率领大军渡江，马氏和将士的家眷仍留在和州（今安徽和县）。当时长江交通线被元军切断，和州孤立，马氏鼓励将士，抚慰眷属，稳定后方。攻下集庆（今南京市）以后，由于战争的需要，她还亲手为将士缝衣做鞋。元至正二十年（公元1360年），陈友谅率兵东下，直逼江宁（今江苏省南京市郊），朱元璋亲自领兵抵御。强敌兵临城下，城中的官员、居民有的打算逃难，有的忙着窖藏金银，囤积粮食。马氏却镇静自若，把自己的金帛全都拿出来犒赏士兵，稳定了军心，为朱元璋获得胜利起了重要作用。
位居皇后
1368年（洪武元年）正月，朱元璋登基于应天府（今南京），国号大明，建元洪武，册封马氏为皇后。
马皇后有五子，其中朱橚最为年幼，性格放荡不羁，长大后被封到开封做周定王。马皇后对他极不放心，周定王临行时，便派江贵妃随往监督，还把自己身上的旧布衣脱下来交给江贵妃，并赐木杖一根嘱咐：“周定王有过错，可以披衣杖责。如敢违抗，驰报朝廷。”从此一见着慈母的旧布衣，周王便生出敬畏之情，不敢胡作非为。以严为爱是马皇后对待子女的原则。对宁国公主、安庆公主，马皇后也要求她们勤劳俭朴，不能无功受禄。而对待朱元璋的义子沐英、李文忠等，她慈爱有加，细心照顾视为己出[3]。
诸王的师傅李希颜因一小王顽皮不听话，常用体罚惩治。一天，李希颜用笔管戳了一下一个小王的额角，小王便哭着到朱元璋处诉苦。元璋大怒，正要发作，马皇后急忙从旁劝解说：“乌有以圣人之道训吾子，顾怒之耶！”朱元璋觉得有理，不但没有惩办希颜，反而提升他做左春坊右赞善。
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